U-Blot® NC 印跡膜（0.2 μm）

U-Blot® 硝酸纖維素（NC）印跡膜是一種純凈的、無支撐的硝酸纖維素微孔膜，用于從各種凝膠基質中轉移蛋白質和核酸。

這款轉印印跡膜有兩種孔徑：0.2μm 和 0.45μm，可結合各種分子量的物質：

• 0.45μm孔徑：適用于大多數蛋白質樣品，并提供更高的檢測靈敏度。

• 0.2μm孔徑：適用于分子量低于20,000的蛋白質，可更好地吸附和保留小蛋白質。

U-Blot®  硝酸纖維素（NC）印跡膜的拉伸強度使它相比于其他品牌的NC膜撕裂和開裂的可能性更小，此膜對蛋白和核酸都具有較高的結合容量，使其能較好的應用于免疫及核酸檢測。

1. 用SDS PAGE凝膠分離蛋白質樣品和蛋白Marker。

2. 小心地裁切和放置凝膠，并將凝膠在冷轉移緩沖液中平衡5~20分鐘。

3. 將膜和濾紙切成適合凝膠的尺寸。將PVDF膜在甲醇中預濕20秒，直至其從不透明的白色變為均勻的半透明灰色，然后浸泡在超純水中1-2分鐘，去除試劑殘留；隨后在冷轉移緩沖液中平衡2-3分鐘，直至可以使用。

使用提醒：

膜潤濕后，請勿使其變干。如果膜部分變干（變成不透明的白色），也必須重新潤濕。

4. 依次組裝轉印裝置，轉印夾子→海綿墊→濾紙→預濕的膜→裁切好并預濕的凝膠→濾紙→海綿墊→轉印夾子，每放置一層要注意避免起皺、折疊或存在氣泡（可利用切膠板等工具輕輕趕壓氣泡，使每層緊密貼合）

5. 按照所用轉印裝置說明設置運行條件等，開始轉印。

6. 轉印結束后，取出印跡膜，并在超純水中短暫沖洗去除凝膠碎屑。印跡膜可以風干儲存，也可以立即使用用于免疫檢測步驟。

成功進行蛋白質印跡實驗的一些關鍵因素，例如蛋白質濃度、封閉液和抗體濃度，可能需要在以下方案中進行優化。

標準免疫檢測

1. 如果印跡膜已干，請將其重新浸濕，浸泡在甲醇中 15 秒，或直至其顏色從不透明的白色變為半透明的灰色。

2. 用超純水沖洗印跡膜 1 分鐘。

3. 將印跡膜放入封閉緩沖液中，輕輕攪拌孵育 1 小時。

4. 將一抗稀釋于商品化抗體稀釋液、洗滌緩沖液或封閉緩沖液中。

5. 將印跡膜放入稀釋的一抗溶液中，室溫孵育 1 小時（或 4°C 過夜），輕輕攪拌。

6. 使用洗滌緩沖液（含 Tween®-20 表面活性劑的緩沖液（TBST 或 PBST））洗滌印跡膜 3-5 次，每次 5 分鐘。

7. 將二抗稀釋于商品化抗體稀釋液、洗滌緩沖液或封閉緩沖液中。

8. 將印跡膜放入稀釋的酶標記二抗溶液中，室溫孵育1小時。

9. 用洗滌緩沖液洗滌印跡膜3-5次，每次5分鐘。

10. 將印跡膜放入干凈的容器中，并加入相應的檢測試劑。

11. 按照檢測所用試劑說明書操作，孵育1-5分鐘。

（1） 對于HRP或AP化學發光試劑，將印跡膜暴露于X光膠片或使用成像系統獲取數字圖像。

（2）對于顯色檢測，加入試劑并等待信號出現。